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給大家分享PCR實驗技術及問題解決方案

樣本采集和保存

良好的樣品采集和保存方法對于DNA提取的成敗至關重要，尤其對于珍貴樣品的采集和保存的方式更是需要特別小心和關注。

大部分情況下應盡可能使用新鮮制備的樣品進行后續(xù)實驗，以期獲得最好的結果。但客觀情況是剛采集的組織樣品是不能馬上進行DNA提取，短期內保存運輸可以置于-20℃~0℃，長期保存可直接通過液氮速凍并置于-80℃保存半年。

DNA提取純化

該方案是用酚類試劑變性蛋白質，來對樣本進行裂解，后用苯酚/氯仿抽提，再無水乙醇沉淀。氯仿的作用是去除多余的酚，促進水相與有機相的分離。該提取方法需要多次離心，步驟較為繁瑣，易造成交叉污染。另外，由于終產物中會引入苯酚/氯仿等有機溶劑殘留，對后續(xù)PCR實驗可能會有抑制。

是通過加入各種蛋白酶去除蛋白雜質，從而分離DNA，有效避免試劑的污染，以獲得高產量和高純度的DNA，但缺點是消解蛋白酶的過程費時較多，且純度不穩(wěn)定。

該方案是將 DNA 分子中的磷酸二酯骨架在離液鹽作用下脫水后，使得磷酸基團暴露的同時與硅膠發(fā)生可逆性吸附。硅介質吸附純化法可以通過離心以及真空加壓的方法使裂解液穿過濾膜，可以有效的提取微量的 DNA。靜電力和氫鍵在硅膠與核酸的吸附中起著關鍵作用。該方法在脫氧核糖核酸的鏈長上有一定限制，較小的 DNA 片段(<100 bp)不容易在介質上得到有效吸附。

該方法將純化介質包被在納米級的磁珠表面，通過介質對DNA的吸附，在外加磁場的作用下使DNA附著于磁珠并定向移動，從而達到核酸與其它物質分離的目的。

與其它的方法相比，磁珠法有以下優(yōu)勢：

l  分離快：磁場分離只需幾秒鐘；

l  提取靈敏度高：微量的樣本也可純化分離；

l  純化純度高：核酸與雜質分離完全；

l  提取產量高：每毫克磁珠能吸附500 μg左右的DNA；

l  高通量提取：可同時完成數百個樣品的提??；

l  環(huán)保無毒：提取方案不含有毒成分。

PCR擴增

PCR，又稱聚合酶鏈式反應，基本原理類似于 DNA 的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。該技術可以從被稱為模板DNA的混合物中擴增出一個高數量級特定的目標DNA片段。模板來源有很多種，除了如上述講到的從細胞提取基因組DNA外，還有從RNA逆轉錄來的cDNA等。

一個PCR反應需要包含以下組分：DNA模板、上下游引物、dNTPs、反應緩沖液、DNA聚合酶等，而通常商業(yè)化的試劑會將除DNA模板和上下游引物以外的組分全部預混，以方便科研使用。PCR實驗最需要注意的是做好引物設計和反應程序的設置，一般引物設計通過Premier 5或NCBI在線設計等平臺來設計。

引物設計注意事項

l  引物 3’端最后一個堿基選擇 C 或 G；

l  引物 3’端最后 8 個堿基應避免出現連續(xù)錯配；

l  引物 3’端盡量避免出現發(fā)夾結構；

l  引物 Tm 值控制在 55℃-65℃之間；

l  引物額外附加序列，即與模板非配對序列，不應參與引物 Tm 值計算；

l  引物 GC 含量控制在 40%-60%之間；

l  正向引物和反向引物 Tm 值以及 GC 含量盡可能一致。

PCR產物鑒定與純化

PCR產物可通過瓊脂糖凝膠電泳技術來鑒定產物的質量，包括得到片段的長度、產量、特異性等。

l  跑膠的目的條帶可以通過DNA膠回收試劑盒來回收目標DNA；

l  PCR反應產物也可直接通過PCR產物清潔回收試劑盒進行純化，以用于下游實驗。

進一步對于想要獲得產物DNA堿基序列詳細信息，可將樣本送至測序公司進行測序。

PCR優(yōu)化思路

你送出去設計合成引物的公司會在說明書上提供你的寡核苷酸引物的 Tm，但是我們發(fā)現不同的公司根據他們采用的計算方式所提供的 Tm明顯不一樣。這邊推薦IDT website的引物設計工具OligoAnalyzer在優(yōu)化退火溫度方面非常好用，Tm計算公式如下：

Tm= 2(A+T) + 4(G+C)

其中 A, T, G和C表示你的引物序列中對應的堿基數

Tm與緩沖液的鹽濃度、pH值以及引物濃度有關，但是一般人很少去考慮這些。大部分人會告訴你，為了防止引物二聚體的形成，推薦你退火溫度要比Tm值至少高到10℃。OligoAnalyzer工具在設計引物時也會考慮到模板DNA的二聚體結構。但是我建議退火溫度設定值比你兩個引物最低的Tm低3℃。例如，如果你的前置引物Tm是62℃，后置引物Tm是61℃，那么設定它們的退火溫度為58℃。

如果你擁有一臺具有梯度擴增功能的PCR儀，同時具有足夠量的模板，你可以進行兩到三次的重復試驗。我建議設定一定范圍的退火溫度進行實驗，并評估每個溫度效果。

你曾經有沒有想過到底是誰想出PCR反應的條件和方法，使得變性和退火時間一直以來都保持一致，只有延伸時間可根據你擴增大小進行調整。一般的經驗法則是你每擴增1 kb需要60秒的延伸時間（根據你選用的聚合酶的效率）。例如，如果你擴增一個2 kb的片段，你需設計120秒的延伸時間。對于較短的產物，縮短延伸時間。對于一個200 bp的擴增產物，15到20秒的延伸時間是足夠的。延伸時間過長會引入不必要的非特異性的PCR產物！

Taq DNA聚合酶在PCR反應中用的最多，尤其在驗證目的基因的PCR擴增中。Pyrococcusfuriosus(PFU)聚合酶則廣泛應用于高保真的PCR反應中。

但是也有一些其他的聚合酶對不同的模板有著不一樣的擴增效率。比如：如果你的擴增模板中含有較高的GC含量（超過65%），Thermo Scientific的 Accuprime G-C Rich DNA Polymerase擴增的效果將會更好！

當你購買一管DNA聚合酶時，包裝里會配備一管已經優(yōu)化好的Buffer。正常來說，安裝說明書進行操作是不會錯的。但是我們認為作為一個科研人，了解Buffer組分和濃度對PCR效率的影響很有必要。因為大部分Buffer只是簡單地在某個pH值下進行鹽離子（KCl和MgCl2）的混合。

可以調整鎂離子濃度來改變PCR的效率和保真度。對Taq DNA polymerase，優(yōu)化的鎂離子濃度是1.5到2 mM，因為其他的緩沖液和反應所需的組分有可能會對鎂離子產生螯合作用，從而需要增加鎂離子濃度。最終在設定鎂離子濃度時，會作一個小調整（大約增加0.5 mM）

包括引物長度、GC含量、Tm值、二聚體等等……在這里簡單地介紹優(yōu)化引物濃度。如果添加過多的引物，會增加非特異性結合和引物二聚體。我們認為引物濃度推薦設定為1μM的較低水平效果會好很多。為了提高特異性，引物濃度甚至可以降到0.1 μM，但是可能會減低PCR產量。

dNTPs的濃度不僅會影響PCR的特異性也會影響產量。 太高濃度的dNTP將會降低特異性，太低有可能降低產量。

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